Принципи на хистологичните и цитологичните техники. Фиксация, рязане и оцветяване
В предишната статия видяхме какво може да покаже микроскопът — от живи клетки, наблюдавани във фазов контраст, до нанометрови детайли от клетъчна мембрана под електронен лъч. Но има един въпрос, който подминахме тогава и на който сега е време да отговорим: как изобщо едно парче тъкан, извадено от жив организъм, стига дотам, че да лежи тънко като косъм върху предметно стъкло, готово да разкрие тайните си? Отговорът се крие в поредица от прецизни, почти алхимични на пръв поглед стъпки — фиксация, обработка, рязане и оцветяване. Именно те превръщат едно късче тъкан в четивен биологичен „текст“.
Защо изобщо ни трябва фиксация
Клетките и междуклетъчните вещества са толкова малки, че самото им наблюдение поставя сериозни изисквания към методите на изследване. Проблемът е прост, но фундаментален: в мига, в който тъканта бъде отделена от организма, тя започва да се разгражда — лизиращи ензими и микроорганизми се задействат бързо и безмилостно. Ако искаме да видим тъканта в състояние, близко до това приживе, трябва първо да спрем тази деградация. Точно това е задачата на фиксацията.
Фиксативът не просто „замразява“ биологичните процеси във вътреклетъчните компоненти в приблизително същото състояние, в което са били преди пробата да бъде взета — той и втвърдява тъканта, което прави последващата манипулация с образеца възможна без риск от увреждане. Интересно е, че тъкан, фиксирана след оцветяване, изглежда впечатляващо реалистично под светлинен микроскоп — почти все едно наблюдаваме жива клетка. Тук обаче си струва да направим една важна уговорка. Онова, което всъщност виждаме под микроскопа, не е живата клетка в действие — тя е „спряна“ в момента на фиксацията и вече не функционира. Виждаме по-скоро нейната архитектура: разположението на органелите, границите на мембраните, начина, по който отделните структури са изградени една спрямо друга. С други думи, фиксацията не ни показва самия живот, а принципите, по които той е бил организиран. Именно затова изборът на фиксатив е толкова критичен — от него зависи доколко верен остава този „план“ спрямо реалното състояние на клетката преди намесата ни.
Кои са най-често използваните фиксативи
Съществуват десетки фиксиращи разтвори, но няколко от тях са се превърнали в истински стандарт за хистологичната лаборатория.
Формалинът — воден разтвор на формалдехид, обикновено в концентрация от 5 до 10% — е може би най-разпространеният универсален фиксатив. Прониква бързо в тъканта, не оставя остатъци и изисква само леко измиване след употреба. Най-често се предпочита буфериран неутрален формалин, тъй като причинява прецизно утаяване на протеините без излишни артефакти.
Разтворът на Буен съдържа пикринова киселина в комбинация с формалин и ледена оцетна киселина. Тук е нужно едно важно предупреждение: работата с кристална пикринова киселина крие реален риск от експлозия, затова манипулацията с нея изисква специално внимание.
Алдехидите, като параформалдехида, са отличен избор както за светлинна, така и за електронна микроскопия. Действат бързо и открояват детайлите в цитоплазмата и ядрото с завидна прецизност.
Алкохолите (метилов или етилов) също се използват като фиксативи, макар и с едно съществено ограничение — те втвърдяват тъканта до степен, в която тя става крехка. Затова обикновено се запазват за специални случаи, например при фиксиране на кръв или малки тъканни фрагменти.
Оцетната киселина рядко се използва самостоятелно, но е чест партньор в комбинирани фиксативни разтвори като тези на Буен, Карнуа и Кларк.
Три начина да фиксираме тъкан
Фиксацията не е един-единствен процес — съществуват три основни подхода, всеки подходящ за различна ситуация.
При фиксация чрез потапяне (имерсия) малка част от тъканта просто се потапя в приготвения фиксативен разтвор. Интересен вариант на този метод е да увием образеца в сгъната тънка марля и да го поставим в получената „люлка“ — така фиксативът прониква равномерно от всички страни. Методът работи добре, когато пробата е малка и фиксативът може бързо да проникне навсякъде.
Перфузионната фиксация е значително по-сложна и се прилага, когато фиксативът трябва да достигне до цялата кръвоносна система на организма. Преди самата фиксация кръвоносните съдове се промиват с физиологичен разтвор, съдържащ хепарин и вещество като прокаин хидрохлорид, което фиксира стените на съдовете и предпазва от свиване вследствие на дразнещото действие на фиксатива. Едва след това се въвежда самият фиксативен разтвор. Методът дава превъзходни резултати при фиксация на по-големи тъканни късове и затова е предпочитан в много научни изследвания.
Замразяването е методът на избор в клинична обстановка, когато е нужна бърза диагноза по време на медицинска манипулация — например интраоперативно изследване. Малко парче тъкан се потапя в течен въглероден диоксид, който го охлажда изключително бързо, като най-добри резултати се постигат при малки проби, охладени до температури между -40°C и -60°C. Тук има един детайл, който си заслужава да отбележим: бързото замразяване води до образуване на много малки ледени кристали и минимално увреждане на тъканта, докато бавното замразяване прави точно обратното — образува големи кристали, които буквално разкъсват клетъчните структури отвътре. Затова скоростта на охлаждане не е технически детайл, а е самата разлика между използваем и неизползваем препарат.
От фиксирана тъкан до тънък срез
След като тъканта е фиксирана, тя трябва да премине през серия от стъпки, за да се превърне в тънък слой, монтиран върху предметно стъкло (за светлинна микроскопия) или още по-тънък слой върху медна мрежичка (за електронна микроскопия). По същество процесът минава през три ключови фази: отстраняване на водата от тъканта (дехидратация), просветляване и накрая — потапяне на тъканта в заливаща среда. Конкретните детайли на всяка стъпка зависят от типа тъкан и метода на микроскопия, който предстои да се приложи.
При импрегнирането и заливането просветляващият агент постепенно се замества от заливаща среда. Най-често използвани са парафинът, който се втечнява при 56°C и е стандарт за светлинна микроскопия, и полимерните смоли на оксидна основа — предпочитани при електронна микроскопия. Заливането обикновено протича на два етапа: първо тъканната проба престоява в разтопената среда в термостат, а след това се ориентира в специална форма, залива се с разтопената среда и се оставя да се охлади.
Самото рязане на парафинирани, замразени или заливани в смола тъкани се извършва с уред, наречен микротом. Материалът се реже с изключително остри метални или стъклени ножове, а получените срезове имат дебелина от порядъка на 5 до 12 микрометра при парафинирана тъкан — макар че специални техники понякога изискват срезове до 40–70 микрометра. За електронна микроскопия се използват стъклени или диамантени ножове, а срезовете стават драстично по-тънки — типично между 50 и 110 нанометра. За сравнение: човешки косъм е стотици пъти по-дебел от такъв срез.
Изкуството на оцветяването
Тук идва може би най-визуално впечатляващата част от целия процес. Без оцветяване повечето тъканни срезове са практически безцветни и трудни за интерпретация дори под добър микроскоп. Целта на оцветяването е чрез локално прилагане на определени вещества да се контрастират тъканите и да се придаде цвят на различните компоненти на среза, правейки ги достъпни за наблюдение — а в много случаи оцветяването визуализира и специфични компоненти като мазнини, невронни фибрили или гликоген.
За да разберем как работи оцветяването, трябва да се запознаем с две понятия от химията на багрилата. Частта от молекулата на багрилото, отговорна за поглъщането на светлина, е система от конюгирани двойни връзки, наречена хромофор. „Свързващата“ част, която често действа и като разтворител, се нарича ауксохром. Най-простият механизъм, по който багрилата „залепват“ за клетъчните структури, са електростатичните взаимодействия между молекулите на багрилото и компонентите на клетката — положителни заряди привличат отрицателно заредени молекули багрило и обратно.
Базичните багрила носят положителен заряд и се наричат катионни. Те се привличат към отрицателните заряди в тъканта. Хематоксилинът и толуидиновото синьо са едни от най-използваните базофилни (катионни) багрила — те оцветяват ядрената ДНК, цитоплазмената РНК, сулфатирани полизахариди като хондроитин сулфат и поликарбоксилни киселини като хиалуроновата киселина.
Киселите багрила носят отрицателен заряд и се наричат анионни — привличат се към положителните заряди в тъканта. Еозин Y е класически пример за такова багрило; то оцветява множество протеини (а с това — и множество клетъчни структури), както и извънклетъчни структури като колагена.
Комбинацията между тези две багрила — хематоксилин и еозин (Х&Е, H&E) — е най-широко използваното оцветяване в хистологичната практика и в клиничната медицина изобщо, включително при диагностициране на патологични процеси в биопсичен материал. Именно чрез тази комбинация от катионно и анионно багрило повечето клетъчни съставки (РНК, ДНК, полизахариди) се оцветяват в различни нюанси на синьо и розово, а методът оцветява и извънклетъчния колаген.
Багрилото на Райт е друга комбинация — базично багрило (метиленово синьо) и кисело багрило (еозин). Широко приложимо е при изследване на кръв и костен мозък: базофилните гранули излизат тъмнолилави, ацидофилните (еозинофилните) — червеникави, а цитоплазмата обикновено е синьо-сива, освен ако не съдържа ацидофилни съставки, при което придобива розово-червен оттенък.
Съществуват и специализирани багрила за еластични влакна, използващи относително неспецифични йонни и нейонни разлики между колаген и еластин — в зависимост от конкретната процедура еластичните влакна могат да изглеждат кафяви, тъмнолилави, синьо-черни или дори черни.
Сребърните багрила стоят в основата на методите за сребърна импрегнация. Тук по същество се използват разтвори на сребърен нитрат (а понякога — злато или живак), които импрегнират блокове нервна тъкан и утаяват метални йони върху клетъчните мембрани на неврони и глиални клетки. Тъканните блокове, обикновено с дебелина 0,3 до 0,6 см, се фиксират във формалин, обработват се с разтвор на калиев дихромат и се потапят в разреден сребърен нитрат за няколко дни, като разтворът се сменя ежедневно. Резултатът е впечатляващ — отделни неврони и глиални клетки се открояват в черно на светложълт до белезникав фон.
PAS реакцията (Periodic-acid-Schiff) е специфичен метод за оцветяване на полизахариди. Използва се реактив на Шиф (фуксин), който реагира специфично със свободни алдехидни групи — по този начин се визуализират хидроксилни групи, каквито се срещат например в гликогена.
Отвъд обикновеното оцветяване: имунохистохимия
Понякога не ни трябва просто да оцветим тъкан — искаме прецизно да локализираме конкретен ензим или макромолекула в клетката или върху нейната мембрана. Тук на помощ идва имунохистохимията, която използва естествената способност на имунната система да разпознава чужди молекули (антигени) чрез специфични протеини (антитела).
При директния метод антитяло, свързано директно с багрило, се прикрепя към антигена и по този начин визуализира местоположението му.
При индиректния метод първо се използва немаркирано първично антитяло, което се свързва с антигена от съответната тъкан, а след това се добавя вторично антитяло, свързано с багрило, което се прикрепя към първото, немаркирано антитяло, и по този начин го прави видимо. Индиректният метод е по-чувствителен именно защото сигналът се „усилва“ през допълнителна стъпка.
Трансмисионна електронна микроскопия:
Преди повече от 60 години електронната микроскопия премина от чисто научен интерес към фундаментален инструмент за изучаване на тъканната структура. Общите стъпки при трансмисионна електронна микроскопия (TEM) са концептуално сходни с тези при светлинната микроскопия, но са адаптирани към уникалните изисквания на техниката. Тъканните парченца тук са наистина мънички — обикновено около един кубичен милиметър — специално фиксирани, за да се запази финната цялост на клетъчните съставки, и инфилтрирани с неполимеризирана смола вместо парафин.
Срезовете, обикновено в диапазона 0,02 до 0,1 микрометра, се режат с нож от стъкло или диамант — стоманени остриета просто не работят при такава прецизност. Тези миниатюрни срезове могат да бъдат обработени с разтвори на соли на тежки метали, като оловен цитрат или уранил ацетат, за да се засили тъканният контраст. Солите се свързват с различни структури в клетката, правейки ги електронно-плътни — те буквално стават по-тъмни на електронограмите. След обработката срезовете се монтират върху медни мрежички и се наблюдават с електронен микроскоп: електронен сноп преминава през среза, избива електрони, които формират изображение върху флуоресцентен екран или се улавят като аналогово или дигитално изображение.
Защо всичко това има значение отвъд лабораторията
Може да звучи като чисто техническа поредица от стъпки, но именно тя стои зад всяка патологична диагноза, поставена от биопсия — зад всеки резултат, който казва „доброкачествено“ или „злокачествено“. Изборът на фиксатив, начин на рязане и конкретна оцветителна техника не е случаен ритуал, а целенасочена стратегия — всяка комбинация разкрива различен слой информация за тъканта. H&E ни показва общата архитектура. Имунохистохимията сочи с пръст конкретна молекула. Сребърната импрегнация „осветява“ нервната мрежа, която иначе би останала невидима. Точно тази комбинация от техники превръща едно парче тъкан в разказ, който лекарите и учените могат да прочетат.
В следващата статия от поредицата ще навлезем в самата клетка — ще разгледаме нейната външна морфология, клетъчната мембрана и типовете междуклетъчни връзки, които държат тъканите заедно.
Въпроси:
- Какви фиксатори познавате?
- Какво е имерсионно фиксиране?
- Какво представлява перфузионното фиксиране?
- Основен или киселинен оцветител е хематоксилинът?